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01. 研究背景
(1) 研究問題：這篇文章主要探討了使用MaxCyte流式電穿孔技術(shù)進(jìn)行病毒載體（包括腺相關(guān)病毒和慢病毒）生產(chǎn)的方法和效率。
(2) 研究難點(diǎn)：傳統(tǒng)的病毒載體生產(chǎn)技術(shù)勞動(dòng)密集、步驟多且效率低，難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需求。
(3) 相關(guān)工作：MaxCyte的流式電穿孔技術(shù)作為一種通用的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染平臺，旨在解決病毒載體生產(chǎn)的諸多問題。
02. 研究方法
提出了使用MaxCyte流式電穿孔技術(shù)進(jìn)行病毒載體生產(chǎn)的方法。具體來說包括：
(1) 細(xì)胞類型：該技術(shù)適用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。
(2) 多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染：MaxCyte系統(tǒng)可以同時(shí)轉(zhuǎn)染多個(gè)質(zhì)粒，包括大質(zhì)粒，從而制造復(fù)雜的病毒載體。
(3) 可擴(kuò)展性：MaxCyte系統(tǒng)在不同規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)中表現(xiàn)出一致的高轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活力。
03. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
(1) 大規(guī)模慢病毒生產(chǎn)：在貼壁HEK細(xì)胞中使用MaxCyte STX進(jìn)行四質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。
• HEK 293FT細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前2-3天在10層細(xì)胞工廠中接種。
• 使用流式電穿孔技術(shù)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，每天收集培養(yǎng)基并測量轉(zhuǎn)導(dǎo)單位。
(2) 懸浮細(xì)胞中的慢病毒生產(chǎn)：懸浮適應(yīng)的HEK 293FT細(xì)胞在10L Wave Cellbags中培養(yǎng)，通過流式電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)染慢病毒組件質(zhì)粒。
• 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞被返回Cellbags中。
• 在GMP合規(guī)的核心設(shè)施中進(jìn)行3次生產(chǎn)運(yùn)行，每次運(yùn)行均顯示出高滴度。
(3) 不同規(guī)模下的慢病毒生產(chǎn)一致性：通過靜態(tài)電穿孔和流式電穿孔（使用MaxCyte）。
• 測量轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的慢病毒滴度，結(jié)果顯示無論規(guī)模大小，生產(chǎn)力一致。
(4) 高效的高滴度AAV生產(chǎn)：在貼壁HEK細(xì)胞中使用MaxCyte STX進(jìn)行三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。
• 轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，幾乎100%的轉(zhuǎn)染細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)勁的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
• 通過qPCR分析測量細(xì)胞沉淀中的高滴度AAV。
04. 結(jié)果與分析
(1) 大規(guī)模慢病毒生產(chǎn)：在貼壁HEK細(xì)胞中，使用MaxCyte STX進(jìn)行四質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，每天收集培養(yǎng)基并測量轉(zhuǎn)導(dǎo)單位，結(jié)果顯示高效的生產(chǎn)能力。
(2) 懸浮細(xì)胞中的慢病毒生產(chǎn)：在懸浮適應(yīng)的HEK 293FT細(xì)胞中，使用MaxCyte系統(tǒng)進(jìn)行生產(chǎn)，3次生產(chǎn)運(yùn)行均顯示出高滴度，表明該技術(shù)在懸浮細(xì)胞中的可擴(kuò)展性和一致性。
(3) 不同規(guī)模下的慢病毒生產(chǎn)一致性：通過靜態(tài)和流式電穿孔在HEK細(xì)胞中生產(chǎn)慢病毒，結(jié)果顯示無論規(guī)模大小，生產(chǎn)力一致。
(4) 高效的高滴度AAV生產(chǎn)：在貼壁HEK細(xì)胞中，使用MaxCyte STX進(jìn)行三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示幾乎100%的轉(zhuǎn)染細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)勁的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，并且通過qPCR分析測量到高滴度的AAV。
總體結(jié)論
MaxCyte的可擴(kuò)展電穿孔技術(shù)允許對貼壁和懸浮適應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行高效轉(zhuǎn)染。該技術(shù)能夠共轉(zhuǎn)染多個(gè)質(zhì)粒和大質(zhì)粒，制造復(fù)雜的病毒載體。MaxCyte轉(zhuǎn)染過程的一致性使得無論培養(yǎng)規(guī)模如何，生產(chǎn)產(chǎn)量都具有一致性。高效的懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染簡化了使用MaxCyte過程進(jìn)行病毒載體制造的可擴(kuò)展性。通過MaxCyte電穿孔技術(shù)生成的高滴度AAV展示了該技術(shù)在制造應(yīng)用中的多樣性。
* 本文轉(zhuǎn)載自「拓普百奧」微信公眾號，作者：宇文數(shù)學(xué)（已獲得作者授權(quán)）
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